Biodiesel merupakan bahan bakar alternatif untuk mensubstitusi minyak diesel/solar. Selain dapat dibuat dari minyak nabati, biodiesel juga dapat dibuat dari asam lemak, misalnya PFAD (Palm Fatty Acid Distillate). Dalam proses pembuatannya, terkadang didapati sampel biodiesel dengan kadar asam lemak yang tinggi akibat asam lemak yang tidak terkonversi menjadi biodiesel. Untuk mengetahui komposisi asam lemak dalam biodiesel tersebut, dilakukan analisis dengan GC-MS. Metode preparasi sampel minyak dengan GC-MS yang umum dilakukan adalah dengan melakukan metilasi terhadap sampel. Namun metode tersebut tidak dapat membedakan metil ester dengan asam lemak yang telah menjadi metil ester. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui metode optimum dalam analisis sampel biodiesel untuk mengetahui komposisi asam lemak dan metil ester yang terkandung di dalamnya secara simultan, tanpa melalui proses metilasi terhadap sampel. Optimasi dilakukan dengan perbandingan penggunaan pelarut sampel yang digunakan yaitu methanol, isopropanol, dan heptane serta metode pemanasan pada GC-MS sehingga diperoleh pemisahan kromatogram yang baik. Dari optimasi metode yang dilakukan, penggunaan pelarut isopropanol dengan metode pemanasan bertahap 5 oC/menit dari suhu 40 – 250 oC pada kolom Stabilwax-DA (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm, polyethylene glycol) menghasilkan pemisahan kromatogram yang optimal dalam membedakan asam-asam lemak dan metil-metil ester di dalam sampel biodiesel.